Pembalap berusia 41 tahun itu melakukan debut grand prix di kelas 125cc pada tahun 1996 dan menjadi juara di divisi tersebut pada tahun berikutnya sebelum naik ke kelas 250cc pada tahun 1998 dan memenangkan gelar pada tahun 1999. Untuk tahun 2000, Rossi ditandatangani oleh Honda ke satelit NSR500 yang didukung pabrik dan mendominasi kampanye 2001 untuk memenangkan yang pertama dari tujuh gelar kelas utama.

Untuk era baru MotoGP empat-tak pada tahun 2002 Rossi bergabung untuk tim Repsol Honda, memenangkan gelar pada tahun 2002 dan 2003 sebelum pindah ke Yamaha pada tahun 2004 setelah hubungannya dengan HRC memburuk.

Yamaha tidak memenangkan grand prix sepanjang tahun 2003, tetapi Rossi membawa M1 yang telah dirubah, menjadi kemenangan dalam balapan pertamanya dengan motor di Afrika Selatan setelah duel dengan Max Biaggi dan akan memenangkan gelar.

Rossi kembali menjadi juara pada tahun 2005, tetapi kampanye yang sulit pada tahun 2006 dan 2007 membuatnya menyerahkan gelar kepada Nicky Hayden dari Honda dan Casey Stoner dari Ducati. Rossi menambahkan dua gelar lagi untuk penghitungannya pada tahun 2008 dan 2009, tetapi arus berbalik di Yamaha dan kedatangan Jorge Lorenzo pada tahun 2008 menyebabkan meningkatnya ketegangan.

Harapan gelar Italia 2010 pupus ketika kakinya patah saat latihan untuk GP Italia, dengan Lorenzo akan memenangkan kejuaraan. Rossi membuat langkah besar ke Ducati untuk 2011, tetapi hanya mencetak tiga podium di musim 2011/2012 yang membawa bencana dan kembali ke Yamaha pada 2013.

Kembali ke jalur kemenangan di Assen tahun itu, Rossi menang dua kali pada 2014 dan menjadi runner-up di kejuaraan sebelum memasang biaya untuk gelar 2015 dalam pertempuran sengit dengan rekan setimnya di Yamaha Jorge Lorenzo. Setelah menuduh Marc Marquez berkonspirasi dengan Lorenzo untuk menyabotase harapan gelarnya di Australia, aspirasi kejuaraan Rossi berantakan di Malaysia ketika insiden kontroversial dengan Marquez membuatnya gagal start di final Valencia.